Instytut Biologii Medycznej PAN

Zapraszamy zainteresowane podmioty do kontaktu w kwestii wyceny indywidualnych usług związanych ze zintegrowaną identyfikacją, screeningiem i produkcją (do dużej skali laboratoryjnej) białek rekombinowanych. Jesteśmy w stanie zapewnić profesjonalną asystę na poziomie doradczym i wykonawczym. Przykładowy pipeline badawczo-rozwojowy, który może być w całości wykonany w naszej jednostce:

• Identyfikacja genów kodujących białka o pożądanych aktywnościach, występujących w naturze, w bazach danych sekwencji genetycznych
• Produkcja białek na małą skale (do 100 µg) na drodze translacji in vitro
• Badanie aktywności enzymatycznej metodami typu ELISA, hydrolizy fluorogenicznych substratów lub hamowania wzrostu bakterii w hodowlach płynnych
• Selekcja korzystnego wariantu genu pochodzącego z natury, a następnie mutageneza in silico w celu zwiększenia aktywności enzymatycznej, stabilności, powinowactwa itp.
• Ponowna translacja in vitro zmutowanych wariantów białka
• Ponowne badanie aktywności lub stabilności termicznej/chemicznej metodą nanoDSF lub powinowactwa (dynamiki asocjacji i dysocjacji) białka i ligandu metodą BLI
• Selekcja najkorzystniejszego zmutowanego wariantu, konstrukcja wektora i wklonowanie do systemu ekspresyjnego
• Ekspresja w małej skali laboratoryjnej (do 2L hodowli), optymalizacja warunków homogenizacji/sonikacji oraz oczyszczania rekombinowanego białka (FPLC)
• Ekspresja w dużej skali laboratoryjnej, hodowla bioreaktorowa o objętości roboczej od 3 do 16 litrów. Optymalizacja warunków hodowli i skalowanie produkcji do skali pilotowej.

Możliwe obszary zastosowania:

• Poszukiwanie nowych białek do zastosowań przemysłowych, medycznych lub badawczych
• Potwierdzanie aktywności kandydatów na białka enzymatyczne, wytypowanych na drodze analiz bioinformatycznych
• Adaptacja enzymu o potwierdzonej laboratoryjnie aktywności do produkcji przemysłowej
• Przyspieszenie badań nad uzyskaniem pożądanej cechy na drodze mutagenezy ukierunkowanej
• Park technologiczny oferujący światowej klasy aparaturę naukową do pomiarów właściwości, jakości i oddziaływań białek rekombinowanych (termoforeza mikroskalowa, elektroforeza kapilarna, BLI, nanoDSF, qPCR, ultrawirówka)

Wykaz wybranych indywidualnych usług badawczych.

Koszty usług będą podlegać indywidualnej wycenie zależnie od zakresu usług orazindywidualnych potrzeb usługodawcy. Jesteśmy otwarci na wspólną realizację projektów badawczych i wdrożeniowych, zarówno w charakterze konsorcjanta jak i usługobiorcy (usługa badawcza).

Usługi bioinformatyczne

• Poszukiwanie wariantów genów potencjalnie kodujących poszukiwane białko w bazach danych sekwencji nukleotydowych pochodzących z natury
• Mutageneza in silico – celowana zmiana sekwencji genu w oparciu o znane struktury, sekwencje genów spokrewnionych, dokowanie molekularne itp. mająca na celu uzyskanie zmutowanego wariantu białka o potencjalnie korzystniejszych cechach użytkowych

Translacja in vitro

• Produkcja do 100 µg białka bezpośrednio w probówce, z pominięciem żywego gospodarza ekspresyjnego, wykorzystując system ExiProgen™ (Bioneer). Metoda pozwala na wydajny czasowo i kosztowo screening różnych wariantów enzymu w mikro skali. Metoda ograniczona jest do białek, które ulegają ekspresji w systemach E. coli.
• Badanie profilu białkowego próbki w mikroskali metodą elektroforezy kapilarnej

Badanie aktywności enzymatycznej

• Pomiary hydrolizy substratów fluorogennych
• Testy ELISA
• Testy inhibicji wzrostu wybranych bakterii w hodowli płynnej
• Badanie wpływu białka na ekspresje wybranych genów w komórkach bakteryjnych lub w eukariotycznych hodowlach komórkowych in vitro, metodą real-time RT-PCR

Pomiary oddziaływań metodą BLI (Interferencji biowarstwy) lub termoforezy mikroskalowej

• Pomiar powinowactwa: stałych asocjacji i dysocjacji pomiędzy białkiem i ligandem (białkowym lub małocząsteczkowym)
• Badanie specyficzności i powinowactwa przeciwciał
• Pomiar parametrów wiązania się białka z cząsteczkami wirusowymi, wirusopodobnymi (VLP) oraz nanocząsteczkami
• Pomiar parametrów wiązania się białka z kwasami nukleinowymi

Pomiary stabilności białek metodą nanoDSF (Nano różnicowej fluorometrii skaningowej)

• Określenie stabilności temperaturowej białka
• Określenie odporności na wybrane chemiczne czynniki denaturujące

Ekspresja w systemach bakteryjnych

• Konstrukcja wektorów ekspresyjnych i transformacja komórek gospodarza ekspresyjnego
• Hodowla wytrząsana w skali 0,2 – 2 litrów podłoża
• Hodowla bioreaktorowa w skali 3 – 16 litrów podłoża
• Eksperymenty optymalizacyjne w hodowli bioreaktorowej, przygotowanie do skalowania procesu
• Domyślnie jako system ekspresyjny wykorzystujemy E. coli, ale przy większych projektach zwiększenie skali produkcji może zostać rozważone w innych systemach ekspresyjnych.

Odzyskiwanie i oczyszczanie białka z biomasy

• Sonikacja lub homogenizacja mechaniczna biomasy w celu uwolnienia wewnątrzkomórkowych białek rekombinowanych
• Dobór koktajlu inhibitorów proteaz bakteryjnych dla planowanych procesów produkcji na większą skalę
• Próba renaturacji białka uwięzionego w ciałach inkluzywnych (jeżeli występują)
• Oczyszczanie wybranego białka z lizatu metodą FPLC w oparciu o metki histydynowe lub metody bezmetkowe (kolumny jonowymienne, hydrofobowe lub wykluczenia wielkości)
• Badanie profilu białkowego, czystości produktu metodami elektroforezy białkowej SDS-PAGE oraz potwierdzenie specyficzności produktu metodą Western-Blot (o ile są dostępne odpowiednie przeciwciała lub produkt posiada metkę białkową)
• Dobór i optymalizacja systemu buforowego do przechowywania oraz do prowadzenia reakcji enzymatycznej

Kontakt
prof. dr hab. Jarosław Dziadek
tel.: +48 42 27 23 633
e-mail: jdziadek@cbm.pan.pl