Instytut Biologii Medycznej PAN

Tematyka badawcza

Podstawowym polem zainteresowania Pracowni Regulacji Transkrypcyjnej są mechanizmy regulacji ekspresji ludzkich genów związanych z odpowiedzią i opornością na szkodliwe czynniki środowiskowe, w tym zwłaszcza genów kodujących białka oporności wielolekowej i enzymy homeostazy redoks. Celem prowadzonych przez nas badań jest poznanie szczegółowych mechanizmów skoordynowanej indukcji i/lub represji badanych genów na poziomie transkrypcji i zastosowanie uzyskanych wyników w praktyce biotechnologicznej (do konstrukcji komórkowych bioczujników reporterowych).

Aktualnie realizowane projekty:

  • Konstrukcja panelu reporterowych linii komórkowych do badania wpływu substancji farmakologicznie czynnych na ekspresję białek oporności wielolekowej.

  • Mechanizmy regulacji ekspresji genu ABCC6.

  • Ekspresja i rola elementów układu tioredoksynowo-peroksyredoksynowego w komórkach ludzkiego śródbłonka naczyniowego.

  • Wpływ czynników zewnętrznych na endogenną produkcję reaktywnych oksydantów (RFT, RFA) w komórkach hodowanych in vitro .

  • Mechanizmy regulacji ekspresji genu BLVRA.

Konstrukcja panelu reporterowych linii komórkowych do badania wpływu substancji farmakologicznie czynnych na ekspresję białek oporności wielolekowej.

Zjawisko oporności wielolekowej, wywołanej ekspresją białek transportowych z nadrodziny ABC, to jedna z najważniejszych przyczyn niepowodzenia chemoterapii przeciwnowotworowej. Białka oporności wielolekowej działają jako aktywne transportery błonowe, usuwające cząsteczki leku na zewnątrz komórki nowotworowej i w ten sposób uniemożliwiające osiągnięcie w komórce stężenia terapeutycznie aktywnego (cytotoksycznego). Dodatkowym problemem jest tendencja do indukcji ekspresji białek oporności wielolekowej pod wpływem ekspozycji nowotworu na leki, a także na inne czynniki środowiskowe. Zdolność danej substancji chemicznej (zwłaszcza przeznaczonej do zastosowania farmakologicznego) do zwiększania ekspresji białek oporności wielolekowej w komórkach nowotworowych musi koniecznie podlegać ocenie, jeżeli narażeni na jej działanie mogą być pacjenci z chorobą nowotworową. Celem naszego projektu badawczego jest konstrukcja panelu reporterowych linii komórkowych (na bazie stabilnie transfekowanych ludzkich linii pochodzenia nowotworowego) umożliwiających łatwą ocenę w formacie wysokoprzepustowym ( high-throughput screening ) wpływu badanych substancji na transkrypcyjną regulację genów dla ludzkich białek oporności wielolekowej.

Mechanizmy regulacji ekspresji genu ABCC6.

Produkt ludzkiego genu ABCC6/MRP6 to błonowe białko transportowe z nadrodziny transporterów ABC. Podlega on ekspresji przede wszystkim w bocznopodstawnej domenie błony komórkowej spolaryzowanych komórek wątroby i nerki. Choć fizjologiczna funkcja białka ABCC6 nie jest znana, mutacje w kodującym je genie są czynnikami sprawczymi dziedzicznej choroby pseudoxanthoma elasticum , której etiologia związana jest z wapnieniem włókien elastynowych w tkance łącznej. Polem naszego zainteresowania są mechanizmy regulujące in vivo ekspresję genu ABCC6 , warunkujące jego wzór ekspresji tkankowej i indukcję ekspresji podczas rozwoju i różnicowania. W naszym laboratorium po raz pierwszy sklonowano i scharakteryzowano podstawową sekwencję promotorową tego genu, a we współpracy z Instytutem Enzymologii Węgierskiej Akademii Nauk (Prof. A. Varadi) udowodniliśmy kluczową rolę metylacji DNA w epigenetycznej regulacji jego ekspresji. Obecnie nasze wysiłki koncentrują się m.in. na wyjaśnieniu roli polimorfizmów genetycznych w obrębie promotora ABCC6 w molekularnych podstawach zróżnicowania patologicznych symptomów pseudoxanthoma elasticum.

Ekspresja i rola elementów układu tioredoksynowo-peroksyredoksynowego w komórkach ludzkiego śródbłonka naczyniowego.

Komórki organizmów żyjących w warunkach aerobowych, w tym również ludzkie, wykształciły skomplikowane i ściśle regulowane systemy służące do bezpiecznego dla komórki redukowania nadmiaru generowanych w trakcie fizjologicznego metabolizmu reaktywnych oksydantów. Układ tioredoksynowo-peroksyredoksynowy to wysoce skomplikowany system, którego kluczowe elementy to białka tworzące szlaki transferu elektronów (układy redoks): NADPH - reduktaza tioredoksynowa - tioredoksyna - peroksyredoksyna - nadtlenek oraz sestryna/sulfiredoksyna - peroksyredoksyna - nadtlenek. Celem naszych badań jest weryfikacja hipotezy, że warunkach stresu oksydacyjnego w komórkach śródbłonka naczyniowego indukcji ulega ekspresja białek układu tioredoksynowo-peroksyredoksynowego, co zapewnia wzmożoną i odrębną od układu glutationowego i drobnocząsteczkowych antyoksydantów nieenzymatycznych ochronę komórek przed skutkami oddziaływania reaktywnych oksydantów.

Wpływ czynników zewnętrznych na endogenną produkcję reaktywnych oksydantów (RFT, RFA) w komórkach hodowanych in vitro.

Chociaż reaktywne formy tlenu (RFT) i azotu (RFA) znane są przede wszystkim ze swego niekorzystnego wpływu na komórki poprzez bezpośrednie uszkadzanie biochemicznych składników komórek, ze względu na swe szczególne własności chemiczne są one często wykorzystywane przez organizm ludzki do własnych celów. Dlatego komórki ludzkie wyposażone są w wiele systemów enzymatycznych służących do fizjologicznej generacji endogennych reaktywnych oksydantów (najbardziej znanym z nich jest oksydaza NADPH służąca wywołaniu "wybuchu tlenowego" w neutrofilach, gdzie reaktywne oksydanty mają działanie bakteriobójcze). Niektóre reaktywne oksydanty (nadtlenek wodoru, tlenek azotu) są również przez komórki wykorzystywane jako pośrednie mediatory w szlakach przekaźnictwa sygnałów. Ze względu na potencjalną szkodliwość reaktywnych oksydantów ich produkcja w komórce musi być ściśle kontrolowana i regulowana, jednak w większości przypadków niewiele wiadomo na temat mechanizmów molekularnych tej regulacji. W naszym laboratorium staramy się identyfikować egzogenne czynniki wywołujące wzrost produkcji endogennych reaktywnych oksydantów w ludzkich komórkach oraz prześledzić szlaki przekaźnictwa sygnałów odpowiedzialne za działanie tych czynników. W ramach tego projektu badawczego udało nam się m.in. wykazać, że anizomycyna powoduje znaczący wzrost produkcji reaktywnych form tlenu w komórkach nowotworowych przez indukcję ekspresji komórkowych oksydaz NAD(P)H.

Mechanizmy regulacji ekspresji genu BLVRA.

Reduktaza biliwerdynowa to jeden z głównych enzymów szlaku katabolizmu hemu, redukujący powstającą w wyniku działania oksygenazy hemowej (znanej jako enzym o ekspresji ściśle regulowanej na poziomie transkrypcyjnym) biliwerdynę do bilirubiny. Lipofilowa bilirubina stanowi z kolei ważny antyoksydant (związek chroniący komórkę przed szkodliwym działaniem reaktywnych oksydantów, takich jak np. wolnorodnikowe pochodne tlenu), którego niskie stężenie w komórkach kompensowane jest szybką ponowną redukcją powstającej w wyniku jej nieenzymatycznego utlenienia biliwerdyny z powrotem do bilirubiny. W mechanizmie tym, zwanym cyklem bilirubinowym, reduktaza biliwerdynowa jest enzymem kluczowym, a jej aktywność determinuje stopień ochrony zapewniany komórce przez bilirubinę. W naszej grupie badawczej poddajemy weryfikacji hipotezę, że reduktaza biliwerdynowa podlega regulacji ekspresji na poziomie transkrypcyjnym przez czynniki prooksydacyjne i że jej indukcja jest w pewnych warunkach skoordynowana z indukcją oksygenazy hemowej w komórkach hodowanych in vitro.